nested PCR
Nested PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy nested) to modyfikacja standardowej metody PCR, polegająca na zastosowaniu dwóch następujących po sobie reakcji amplifikacji z wykorzystaniem dwóch par starterów. W pierwszym etapie amplifikowany jest dłuższy fragment DNA za pomocą pierwszej pary starterów (zewnętrznych), a następnie produkt tej reakcji służy jako matryca w drugiej reakcji PCR z wykorzystaniem drugiej pary starterów (wewnętrznych), które są komplementarne do sekwencji położonych wewnątrz pierwszego amplikonu.
Ta metoda charakteryzuje się znacznie wyższą czułością i specyficznością w porównaniu do standardowego PCR. Podwójna amplifikacja umożliwia wykrycie nawet minimalnych ilości materiału genetycznego, co jest szczególnie istotne w diagnostyce mikrobiologicznej, wirusologicznej oraz w badaniach molekularnych, gdzie poszukiwana sekwencja DNA może występować w śladowych ilościach.
Nested PCR znajduje zastosowanie w diagnostyce chorób zakaźnych (np. wykrywanie HIV, HBV, HCV), identyfikacji patogenów trudnych do hodowli (np. Mycobacterium tuberculosis), diagnostyce prenatalnej oraz w badaniach z zakresu biologii molekularnej. Należy jednak pamiętać, że ze względu na wysoką czułość metody istnieje zwiększone ryzyko kontaminacji i wyników fałszywie pozytywnych, co wymaga rygorystycznego przestrzegania procedur laboratoryjnych.
Powiązane wpisy
- Leksykon chorób i schorzeń
Cyklosporoza – Diagnostyka i diagnoza
Cyklosporoza, wywoływana przez pasożyta Cyclospora cayetanensis, stanowi wyzwanie diagnostyczne ze względu na przerywane wydalanie oocyst i ich niską liczebność w kale, co wymaga pobrania kilku próbek (optymalnie trzech) w odstępach 24-48 godzin oraz zastosowania specjalistycznych technik, takich jak koncentracja kału (np. formalno-octanowa, wirowanie 10 minut przy 500 x g), barwienia zmodyfikowanymi metodami kwasoopornymi lub safraninem, a także mikroskopii fluorescencyjnej UV (filtry wzbudzenia 330-365 nm lub 450-490 nm). Diagnostyka molekularna, w tym PCR i nested PCR celujący w gen 18S rRNA, oraz komercyjne panele multiplex (np. FilmArray BioFire) zwiększają czułość i swoistość wykrywania, choć nie wszystkie panele zawierają cel diagnostyczny dla Cyclospora. W przypadkach negatywnych wyników mikroskopowych, ale silnego podejrzenia klinicznego, wskazane jest rozważenie biopsji jelita cienkiego, aspiratu dwunastniczo-czczo-jelitowego lub endoskopii z pobraniem próbek do analizy mikroskopowej i molekularnej.
badanie molekularne, biopsja jelita cienkiego, Cyclospora cayetanensis, cyklosporoza, cytometria przepływowa, endoskopia, koncentracja kału, mikroskopia fluorescencyjna, nested PCR, pasożyt, przewlekła biegunka, reakcja łańcuchowa polimerazy, region endemiczny, trimetoprim-sulfametoksazol, typowanie sekwencji multilokusowych - Leksykon chorób i schorzeń
Bruceloza – Diagnostyka i diagnoza
Bruceloza, choroba odzwierzęca wywoływana przez bakterie z rodzaju Brucella, charakteryzuje się niespecyficznymi objawami klinicznymi, co utrudnia jej diagnostykę. Złotym standardem jest izolacja bakterii z krwi, płynów ustrojowych lub tkanek, jednak hodowla wymaga długiego czasu inkubacji (7-21 dni) i ma czułość 40-70%, zależną od gatunku (niższa dla B. abortus). Diagnostyka serologiczna opiera się na testach takich jak Rose Bengal Test (RBT), Standard Agglutination Test (SAT) z miano diagnostycznym powyżej 1:160 (obszary nieendemiczne) lub 1:320 (obszary endemiczne), test 2-ME, Coombsa oraz ELISA mierzącej IgM, IgG i IgA. Testy molekularne oparte na PCR, zwłaszcza real-time PCR z sekwencją IS711, oferują wysoką czułość i swoistość, umożliwiając szybką diagnostykę, choć nadal wymagają standaryzacji i walidacji. Diagnostyka powinna uwzględniać wywiad epidemiologiczny oraz różnicowanie z innymi chorobami gorączkowymi, a także stosować algorytmy łączące różne metody w celu zwiększenia dokładności diagnostycznej.
antybiotykoterapia skojarzona, bakteria Brucella, diagnostyka laboratoryjna, dur brzuszny, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, hodowla bakteryjna, izolacja bakterii, MALDI-TOF, nested PCR, PCR w czasie rzeczywistym, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy, posiew szpiku kostnego, reakcja łańcuchowa polimerazy, reaktywność krzyżowa, test amplifikacji kwasów nukleinowych, test Coombsa, test serologiczny, trimetoprim-sulfametoksazol, układ siateczkowo-śródbłonkowy, zapalenie wsierdzia, ziarniniakowe zapalenie wątroby, złoty standard diagnostyczny