Szybki test przepływowy na covid-19
Patofizjologia i mechanizm
Szybkie testy przepływowe (LFT) na COVID-19 to immunochromatograficzne testy jakościowe wykrywające antygeny wirusa SARS-CoV-2, głównie białko nukleokapsydu (N), w wymazach z nosogardzieli, z wynikiem dostępnym w 15-30 minut. Testy te wykorzystują przeciwciała monoklonalne sprzężone z koloidem złota, które wiążą antygeny wirusa, tworząc widoczną linię testową na membranie nitrocelulozowej. W porównaniu do testów PCR, które wykrywają materiał genetyczny wirusa, LFT lepiej identyfikują osoby aktualnie zakaźne, gdyż antygeny są obecne głównie podczas aktywnej infekcji. Czułość testów przepływowych w wykrywaniu aktywnej infekcji wynosi około 80%, a specyficzność około 89% u pacjentów z nowymi objawami. Wczesne testowanie jest kluczowe, gdyż wyższy ładunek wirusowy i krótszy czas trwania objawów korelują z dodatnim wynikiem LFT. W celu poprawy czułości opracowano m.in. test immunologiczny z międzymembraną przepływu bocznego (LFIIT) z granicą wykrywalności 2,0 ng/ml białka N, co stanowi istotny postęp w diagnostyce antygenowej.
- Szybki test przepływowy na COVID-19 – mechanizm działania i patogeneza
- Mechanizm działania szybkiego testu przepływowego
- Szczegółowy mechanizm biochemiczny
- Co wykrywają testy przepływowe na COVID-19?
- Czułość i specyficzność testów przepływowych na COVID-19
- Ulepszenia testów przepływowych na COVID-19
- Nowe podejścia w diagnostyce COVID-19 za pomocą testów przepływowych
- Zastosowania praktyczne testów przepływowych w COVID-19
- Ograniczenia testów przepływowych na COVID-19
- Podsumowanie
Szybki test przepływowy na COVID-19 – mechanizm działania i patogeneza
Szybkie testy przepływowe (ang. Lateral Flow Test, LFT) stały się kluczowym narzędziem w diagnostyce COVID-19 ze względu na możliwość uzyskania wyniku w ciągu 15-30 minut1. Te immunochromatograficzne testy jakościowe opierają się na wykrywaniu antygenów wirusa SARS-CoV-2 w próbce pobranej od pacjenta, podobnie jak działa test ciążowy wykrywający ludzką gonadotropinę kosmówkową2. Zasada działania tych testów opiera się na wykrywaniu cząsteczek docelowych w próbce – w przypadku COVID-19 są to antygeny wirusa3.
Mechanizm działania szybkiego testu przepływowego
W przypadku COVID-19 próbka pobierana jest za pomocą wymazu z nosogardzieli. Wymaz następnie zostaje umieszczony w niewielkiej ilości płynu w celu zawieszenia próbki wraz z ewentualnymi cząstkami wirusa. Po kilku minutach płyn (tzw. analit) umieszczany jest w studzience na dole kasety testowej4. Test składa się z kilku kluczowych elementów:
- Podkładka próbki – miejsce, gdzie umieszczana jest próbka
- Podkładka koniugatu – zawiera odwodnione przeciwciała sprzężone ze składnikiem wizualizacyjnym (zazwyczaj koloidem złota)
- Membrana nitrocelulozowa – miejsce, gdzie zachodzą reakcje immunologiczne
- Strefa detekcji – zawiera linie testową i kontrolną
Gdy próbka zostaje nałożona na test, zachodzi następujący proces:
- Pobieranie próbki – wymaz z nosa lub gardła pobiera materiał od badanej osoby5
- Uwolnienie i wiązanie antygenów – płyn zawierający próbkę przepływa przez podkładkę koniugatu, gdzie antygeny SARS-CoV-2 (jeśli obecne) wiążą się z przeciwciałami sprzężonymi z koloidem złota6
- Migracja – mieszanina przemieszcza się wzdłuż membrany na zasadzie działania kapilarnego6
- Detekcja – jeśli antygeny SARS-CoV-2 są obecne w próbce, wiążą się one z wyznakowanymi przeciwciałami na pasku, tworząc kompleks, który tworzy widoczną linię w obszarze testowym5
Szczegółowy mechanizm biochemiczny
W przypadku testu na COVID-19 firmy Abbott, mysie monoklonalne przeciwciała anty-SARS-CoV-2 są unieruchomione wzdłuż paska testowego. Gdy analit przechodzi przez linię testową, wszelkie antygeny SARS-CoV-2 obecne w analicie wiążą się ze sprzężonymi przeciwciałami testowymi. Oznacza to, że na linii testowej antygeny SARS-CoV-2 działają jak most między unieruchomionymi antygenami testowymi a przeciwciałami wizualizacyjnymi sprzężonymi ze złotem z podkładki uwalniającej koniugat7.
Jeśli w próbce nie ma antygenu COVID-19, nie ma nic, co mogłoby związać sprzężone przeciwciała. Te sprzężone przeciwciała są następnie przenoszone wraz z analitem poza przeciwciała związane z linią testową, więc nie pojawia się żadna linia, co wskazuje na wynik negatywny7. Linia kontrolna działa na innej zasadzie – przeciwciała przymocowane w linii kontrolnej są skierowane przeciwko samemu przeciwciału testowemu i nie dochodzi do mostkowania. Koloid złota przyklejony do przeciwciał testowych stanie się widoczny, potwierdzając, że test działa7.
Co wykrywają testy przepływowe na COVID-19?
Zdecydowana większość szybkich testów przepływowych na COVID-19 nie wykrywa białka kolca (spike protein), które często ulega mutacjom, ale inny rodzaj białka strukturalnego zwanego nukleokapsydem (białko N), które tworzy ochronną otoczkę otaczającą genom wirusa. Białka N nie mają tendencji do mutowania tak bardzo jak białka spike, co oznacza, że testy nadal powinny być w stanie je wykrywać, nawet w przypadku nowych wariantów wirusa8.
W przeciwieństwie do testów PCR, które wykrywają materiał genetyczny wirusa, testy antygenowe LFT wykrywają bezpośrednio białka wirusowe, co czyni je lepszymi do identyfikowania osób aktualnie zakaźnych, a nie tych, które mogły niedawno przejść COVID-19 i nie są już zakaźne (PCR wykryje obie te grupy)9.
Czułość i specyficzność testów przepływowych na COVID-19
Dokładność testów przepływowych wynika z dwóch kluczowych parametrów: czułości i specyficzności. Czułość jest definiowana jako odsetek prawdziwie dodatnich wyników, które są prawidłowo zidentyfikowane przez test (np. osoba ma przeciwciała IgG w próbce, a test wykrywa te przeciwciała). Specyficzność to odsetek prawdziwie ujemnych wyników, które są prawidłowo zidentyfikowane przez test10.
Szybkie testy przepływowe mają niższą czułość niż testy PCR. Jednakże, dotychczasowe badania sugerują, że testy te lepiej identyfikują wyniki dodatnie u osób zakaźnych niż u osób, które mogły niedawno przejść COVID-19 i nie są już zakaźne9. Badania wykazały, że testy przepływowe wykrywają ponad 95% przypadków wykrytych przez PCR i prawidłowo identyfikują 89% przypadków jako ujemne u pacjentów z nowymi objawami11.
Testy przepływowe walidowane w porównaniu z PCR nie są porównywane ze złotym standardem równoważnych pomiarów, ponieważ PCR wykrywa materiał genetyczny wirusa, nawet gdy nie jest on już zakaźny, podczas gdy LFT wykrywa antygeny, które są zazwyczaj obecne tylko podczas aktywnej infekcji12. Dobrze działający test do wykrywania osób wydzielających antygeny SARS-CoV-2 miałby zatem pozorną względną (w stosunku do PCR) czułość nigdy nie przekraczającą 50%. Przekalibrowanie pozornej względnej czułości 50% daje około 80% bezwzględnej czułości w testowaniu osób wydzielających antygeny SARS-CoV-212.
Czynniki wpływające na czułość testów
Zarówno krótszy czas trwania objawów, jak i wyższy ładunek wirusowy były znacząco związane z dodatnim wynikiem testu przepływowego. To podkreśla konieczność testowania we wczesnej fazie zakażenia za pomocą testów przepływowych11. W badaniach wykazano, że testy przepływowe mają podobną dokładność do testów PCR u pacjentów z nowymi objawami11.
Wcześniejsze badania sugerowały, że testy przepływowe mogą być mniej czułe niż PCR w wykrywaniu COVID-19, szczególnie u osób bezobjawowych oraz we wczesnym lub późnym stadium zakażenia, gdy ładunek wirusowy jest najniższy11.
Ulepszenia testów przepływowych na COVID-19
W celu poprawy czułości testów przepływowych na COVID-19 opracowano różne strategie. Jednym z podejść jest zwiększenie stężenia przeciwciał w linii testowej oraz dodanie międzymembrany między podkładką koniugatu a membraną nitrocelulozową, co pozwoliło zwiększyć czułość czterokrotnie i stworzyć nowy prototyp testu zwanego testem immunologicznym z międzymembraną przepływu bocznego (LFIIT)13.
Strategie wdrożone w celu zwiększenia czułości analitycznej obejmowały:
- Dostosowanie stężenia przeciwciał w linii testowej, podwajając ich ilość do 3,0 mg/ml14
- Wprowadzenie dodatkowej warstwy materiału zdolnego do zatrzymania lub spowolnienia przepływu cieczy przez pasek, co umożliwia dłuższy czas reakcji między przeciwciałami a antygenami15
Wyniki pokazały, że LFIIT zapewnił reaktywny sygnał w 19 z 20 testowanych powtórzeń, definiując granicę wykrywalności testu jako 2,0 ng/ml białka N, co jest porównywalne lub nawet lepsze niż większość szybkich testów do wykrywania antygenu SARS-CoV-2 dostępnych na rynku1617.
Nowe podejścia w diagnostyce COVID-19 za pomocą testów przepływowych
Opracowano alternatywną metodę wykrywania aktywnej infekcji koronawirusem, która celuje w RNA o ujemnym sensie, produkt aktywnej replikacji wirusa. Zaproponowano diagnostykę kwasów nukleinowych specyficzną dla nici jako sposób rozróżnienia między aktywnymi i nieaktywnymi infekcjami wirusami RNA oraz prototypowy test przepływowy oparty na CRISPR, który specyficznie wykrywa replikujące się koronawirusy18.
Wykazano, że replikujący się koronawirus myszy, będący modelem dla SARS-CoV, nadal produkuje zarówno swój genom, RNA o dodatnim sensie (+ssRNA), jak i antygenom, RNA o ujemnym sensie (-ssRNA), przez cały proces infekcji w komórkach. Jednak po ustaniu replikacji tylko genom +ssRNA jest nadal wykrywalny z wirusów w mediach hodowlanych pozbawionych komórek gospodarza, co wskazuje, że antygenom -ssRNA może służyć jako marker kompetencji replikacyjnej wirusa i może wskazywać na zakaźność19.
Zalety wykorzystania ujemnego RNA jako markera aktywnej infekcji
Jedną z kluczowych zalet wykorzystania antygenomu -ssRNA jako celu do wykrywania jest jego zdolność do rozróżniania między aktywnymi i nieaktywnymi infekcjami. Jest to ważne rozróżnienie, ponieważ osoby, które wyzdrowiały z wirusa, mogą nadal uzyskiwać wyniki dodatnie przy użyciu innych metod wykrywania celujących w genom +ssRNA, ale niekoniecznie wskazuje to na zakaźność, ponieważ pozostałe fragmenty genomu wirusa mogą dawać wyniki dodatnie przy braku replikacji20.
Ponadto obecność ujemnej nici jest wyraźnym wskaźnikiem aktywnej infekcji, co może pomóc zmniejszyć obciążenie systemów opieki zdrowotnej i zapobiec niepotrzebnej izolacji osób21. Wykorzystanie antygenomu -ssRNA koronawirusa jako markera replikujących się wirusów może być również przydatne do monitorowania skuteczności terapii przeciwwirusowych21.
Użycie nici -ssRNA jako markera pozwala na bezpośrednie wykrywanie replikujących się wirusów, a nie poleganie na pośrednich wskaźnikach, takich jak obecność białek wirusowych lub antygenów22.
Zastosowania praktyczne testów przepływowych w COVID-19
Testy przepływowe odegrały kluczową rolę w testowaniu COVID-19 na całym świecie i uzupełniają inne środki zdrowia publicznego w walce z pandemią23. W Wielkiej Brytanii, po zamknięciu szkół w styczniu 2021 roku, wprowadzono dwutygodniowe testy LFT w Anglii dla nauczycieli, uczniów i gospodarstw domowych uczniów, gdy szkoły ponownie otwarto 8 marca 2021 roku, w celu testowania bezobjawowego1.
Testy są administrowane za pomocą urządzeń przenośnych, produkują wyniki w około 30 minut i mogą być samodzielnie przeprowadzane. Testy przepływowe wykrywające antygen nie są odpowiednie dla osób z objawami COVID-19 – takie osoby powinny uzyskać test PCR924.
W praktyce klinicznej, przeprowadzone badanie było pierwszym, które wykazało, że testowanie antygenowe w punkcie opieki za pomocą testów przepływowych w połączeniu z oceną kliniczną pacjentów objawowych może szybko i dokładnie wykryć zakażenie SARS-CoV-2 w podstawowej opiece zdrowotnej25.
Wyniki badania stanowią podstawę przyszłych strategii powstrzymywania w podstawowej opiece zdrowotnej, które mogą wnieść ważny wkład w kontrolę i zapobieganie pandemii. W kontekście przyszłych złagodzeń zasad lockdownu – oprócz szczepień – wczesne wykrywanie osób z zakażeniem poprzez wiarygodne testy będzie konieczne do kontrolowania COVID-1925.
Ograniczenia testów przepływowych na COVID-19
Pomimo zalet, testy przepływowe mają pewne ograniczenia:
- Niższa czułość w porównaniu z testami PCR, szczególnie u osób bezobjawowych oraz we wczesnym lub późnym stadium zakażenia11
- Nie wykrywają niewirulentnego wirusa w późniejszych stadiach wydzielania wirusa, które mogą być wykryte przez molekularne testy PCR24
- Nie wykrywają personelu, który wraca do zdrowia po przebytym wirusie24
- Wyniki dodatnie wymagają potwierdzenia testami PCR9
Niektórzy naukowcy spoza rządu wyrazili poważne zastrzeżenia pod koniec 2020 roku dotyczące wykorzystania testów LFD Innova do przesiewowych badań na Covid. Czułość testów używanych w 2022 roku wynosiła około 70%23.
Podsumowanie
Szybkie testy przepływowe na COVID-19 są cennym narzędziem w odpowiedzi na pandemię. Ich łatwość użycia i szybkie wyniki sprawiają, że są skutecznym narzędziem do wczesnego wykrywania i izolacji przypadków, zmniejszając w ten sposób transmisję5. Ciągły rozwój technologii testów przepływowych, w tym zwiększanie czułości i opracowywanie nowych podejść, takich jak wykrywanie RNA o ujemnym sensie, może dodatkowo poprawić ich użyteczność w diagnostyce COVID-19 i kontroli rozprzestrzeniania się wirusa.
Testy przepływowe są szczególnie skuteczne w wykrywaniu osób zakaźnych, które stanowią największe ryzyko dla zdrowia publicznego. Ustanowienie możliwie najniższej granicy wykrywalności jest niezwykle ważne podczas opracowywania testu na antygen SARS-CoV-2, ponieważ izolacja pacjentów jest w dużym stopniu uzależniona od dodatniego wyniku testu antygenowego, gdy zakaźność jest znacznie bardziej prawdopodobna16.
Kolejne rozdziały
Zapraszamy do dalszego czytania naszego leksykonu.
Wybierz kolejny rozdział z menu poniżej, aby otworzyć nową podstronę kompedium wiedzy i uzyskać szczegółowe informację o leku, substancji lub chorobie.