Naukowcy z Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie opracowali metodę, która pomoże we wcześniejszym zdiagnozowaniu uszkodzenia nerek spowodowanego cukrzycą. Pozwoli ona również rozpoznać ryzyko wystąpienia niewydolności nerek.
Jak powiedziała w czwartek PAP członkini zespołu wynalazców dr hab. Ewa Stępień, wynalazek został zgłoszony do międzynarodowego urzędu patentowego (konkretnie jako opracowanie nowego biomarkeru uszkodzenia nerek u pacjentów, którzy cierpią na cukrzycę - PAP), a w tej chwili jest chroniony prawem własności intelektualnej. O nowej metodzie wie już międzynarodowe środowisko uczonych - informacje o wynalazku znalazły się m.in. w czasopiśmie "Nanomedicine".
Badacze odkryli, że mikropęcherzyki znajdujące się w moczu mogą zostać nowym biomarkerem choroby cukrzycowej nerek. „Na taką wiadomość czeka wielu pacjentów. W Polsce na cukrzycę choruje ponad 2 mln osób. U ponad 10 proc. z nich rozwijają się powikłania, więc zapotrzebowanie na diagnostykę takich dolegliwości jest ogromne” - czytamy w komunikacie UJ przesłanym mediom.
Zespół z Uniwersytetu Jagiellońskiego (dr hab. Ewa Stępień, Agnieszka Kamińska) przy współpracy naukowców z Instytutu Fizyki Jądrowej PAN (dr Macieja Romana i dr hab. Czesławy Paluszkiewicz) nad rozwiązaniem pracował od 2014 r.
Definicja biomarkera w medycynie jest szeroka. Biomarkerem może być zarówno cząsteczka czy substancja, jak i wskaźnik fizyczny - na przykład ciśnienie krwi jest biomarkerem nadciśnienia, idąc dalej tym tropem, poziom cukru jest biomarkerem cukrzycy.
„My odnaleźliśmy takie biomarkery w moczu, które do tej pory nie były wykorzystywane do diagnostyki. Od dawna podejrzewano, że one występują i nawet je opisano, tylko nie korelowano ich występowania ze stopniem zaawansowania niewydolności nerek, jak i ze stopniem zaawansowania cukrzycy” – wyjaśniła Ewa Stępień, kierownik Zakładu Fizyki Medycznej w Instytucie Fizyki UJ.
Dodała, że w moczu znajdują się mikropęcherzyki pochodzenia komórkowego. Naukowcy, gdy zaczęli się im przyglądać, uznali, że są one reprezentatywne dla komórek, od których pochodzą.
„Badania widma w spektroskopii ramanowskiej tj. spektroskopii stanów oscylacyjnych cząsteczek, pozwalają określić skład molekularny na poziomie zawartości cząsteczek białka, kwasów nukleinowych, lipidów, tłuszczy w komórce i w jakimś obiekcie biologicznym, a w tym przypadku w naszych mikropęcherzykach” - wyjaśniła Stępień.
Teraz przed naukowcami badania kliniczne wynalazku oraz stworzenie prototypu testu. Na pytanie, jakie mogą być zastosowania nowego biomarkera, badaczka z UJ mówi, że przede wszystkim w diagnostyce np. w testach przyłóżkowych typu „point of care” czy w dużych laboratoriach. Test ma być nieinwazyjny (próbka moczu) i ma nie obciążać pacjenta, a diagnozować go na wczesnym etapie choroby. Wielką zaletą tej metody jest – jak podkreślają uczeni – jej wysoka czułość. (PAP)
Komentarze
[ z 6]
Takie osiągnięcia pozwalają na wprowadzenie diagnostyki powikłań cukrzycy na nowe poziomy. Mimo, że dużo już wiemy na ten temat to nadal jest jeszcze wiele do odkrycia poza tym gdy już naukowcom uda się w miarę dobrze poznać różne opcje diagnostyczne łatwiej będzie również rozwijać dalej terapie lub zastosować leczenie nowego typu mające na celu zapobieganie patologicznym zmianom w nerkach.
Cukrzyca to bardzo podstępna choroba, która bardzo często nie daje żadnych objawów. Bardzo ważne jest to aby regularnie badać poziom glukozy we krwi. Wiele osób nie robiąc tego, a dodatkowo prowadząc niezdrowy tryb życia naraża się na rozwój cukrzycy. W takich przypadkach istnieje właśnie duże ryzyko rozwoju chociażby neuropatii, retinopatii czy tak jak wspomniano w artykule nefropatii. Według mnie to bardzo dobrze, że udało się opracować taki biomarker. Jestem bardzo zadowolona z tego, że do takiego odkrycia doszło właśnie w naszym kraju. Być może dzięki temu takie rozwiązanie będzie mogło być dużo wcześniej wprowadzone. Im wcześniej jakaś choroba zostanie wykryta tym większe są szanse na jej wyleczenie lub zmniejszenie ilości powikłań, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia, a nawet życia.
Każde informacje o nowych odkryciach, które pomogą w diagnostyce jakichkolwiek chorób niezwykle mnie cieszy. Według szacunkowych danych przewlekła choroba nerek może dotyczyć 4,5 miliona Polaków, z czego aż 90 proc. nie zdaje sobie z tego sprawy – choroba rozwija się podstępnie i latami. Większość zgonów z powodu PChN to zgony przedwczesne. Przewlekła choroba nerek (PChN) to drugie pod względem częstości zapadnia przewlekłe schorzenie w Polsce. PChN to wieloobjawowy zespół chorobowy, którego objawy utrzymują się przynajmniej ponad 3 miesiące. Do rozwoju choroby dochodzi w wyniku trwałego uszkodzenia lub zmniejszenia liczby czynnych nefronów niszczonych przez różnorodne procesy chorobowe toczące się w miąższu nerek. Poza przewlekłą postacią niewydolności nerek spotyka się również jej odmianę o ostrym przebiegu, do której dochodzi w wyniku urazu, niedokrwienia czy działania substancji toksycznych – w przeciwieństwie do PChN w jej przypadku możliwe jest przywrócenie właściwego funkcjonowania nerek. W początkowych stadiach PChN może przebiegać bezobjawowo, wręcz skrycie, a pacjent przez długi czas nie będzie odczuwał żadnych niepokojących symptomów. Niestety, im później wykryta, tym rokowania mogą być gorsze. Do najczęstszych przyczyn PChN zaliczamy: cukrzycową chorobę nerek, nefropatię nadciśnieniową, kłębuszkowe zapalenie nerek, cewkowo-śródmiąższowe choroby nerek, wielotorbielowate zwyrodnienie nerek, ostrą niewydolność nerek i nefropatię niedokrwienną. Czynnikami wpływającymi na podniesienie ryzyka zachorowania są m.in.: cukrzyca, otyłość, obciążenia rodzinne, palenie papierosów oraz częste zażywanie leków przeciwzapalnych i przeciwbólowych. Eksperci podkreślają, że niezwykle ważne jest wykonywanie badań przynajmniej raz w roku. Jeśli potencjalny chory jest w grupie ryzyka – dwukrotnie. Przewlekła choroba nerek to schorzenie właściwie nieuleczalne. W terapii stosuje się leczenie nefroprotekcyjne (farmakologiczne i żywieniowe) oraz nerkozastępcze (hemodializa, dializa otrzewnowa i ostatecznie przeszczep nerki). Kluczowe we właściwej diecie u pacjenta z PChN jest takie ukształtowanie sposobu odżywania się, by ograniczyć przyjmowanie białek – jest to jednak wyniszczające i obciążające dla organizmu. Taki chory wymaga nie tylko opieki dietetyka, ale również właściwej suplementacji. Specjaliści wskazują, że dobrym preparatem wzbogacającym dietę niskobiałkową mogą być ketoanalogi aminokwasów. Zapobiegają one zubożeniu diety, a w konsekwencji niedożywieniu i osłabieniu organizmu. Zadaniem dietetyka jest nie tylko zaplanowanie optymalnej dla pacjenta ilości energii, białka, pozostałych makro- i mikroskładników, ale także ocena realizacji zaleceń dietetycznych. Niestety, w Polsce dostęp do dietetyka w poradniach nefrologicznych jest bardzo ograniczony. NFZ nie refunduje porad dietetycznych, mimo że korzyści wynikające z dietoterapii (nie tylko dla pacjenta) są powszechnie znane i poparte wynikami wielu badań. Warto zatem zadać pytanie: dlaczego w Polsce poradnictwo dietetyczne dla pacjentów nefrologicznych nie istnieje jako świadczenie gwarantowane ani w podstawowej opiece zdrowotnej, ani też w ambulatoryjnej opiece specjalistycznej? Nie wynika to z pewnością z braku wykształconych dietetyków. Zastosowanie leczenia żywieniowego na większą skalę pozwoliłoby nie tylko na późniejsze włączaniu u chorych bardziej obciążających form terapii, ale również na ograniczenie kosztów leczenia przewlekłej choroby nerek - oraz jej powikłań, np. chorób układu sercowo-naczyniowych - dla całego systemu. Już sama dializoterapia stanowi bardzo duże obciążenie finansowe, nie mówiąc o pogorszeniu jakości życia chorego. Koszty niezbędnej terapii 31 000 pacjentów, leczonych nerkozastępczo dializami lub przeszczepami nerki, wyniosły w roku 2018 prawie 2 mld złotych.
W życiu, jak w pokerze – czasami trzeba powiedzieć: sprawdzam! Ta zasada bezpieczeństwa obowiązuje w wielu sferach życia, dotyczy też zdrowia. Zdrowie od czasu do czasu warto po prostu skontrolować. Nawet wówczas, gdy nic nam nie dolega. Na tym polega nowoczesna medycyna – badamy, czy organizm działa prawidłowo, gdy jesteśmy zdrowi, bo stawiamy na to, żeby ubiec ewentualną chorobę. A już koniecznie powinniśmy skontrolować zdrowie, gdy pojawiają się dolegliwości. O obu regułach pamiętajmy zwłaszcza wówczas, gdy zaczynamy drugie pięćdziesiąt lat życia lub mamy tych lat jeszcze trochę więcej. Badania mogą nieść ze sobą bardzo wiele informacji – podkreślają specjaliści: interniści, nefrolodzy, diabetolodzy, kardiolodzy. Osłabienie z niedokrwistości, znużenie. Sucha skóra, siniaki i obrzęki. Zaburzenia akcji serca. Ból kości oraz złamania. Zaburzenia pamięci i kłopoty ze snem. Nocne oddawanie moczu. Co mają ze sobą wspólnego składniki tej wyliczanki? Takie objawy mogą sygnalizować nieprawidłowe działanie nerek. Recz jest ważna. Coraz więcej osób dotyka przewlekła niewydolność nerek, co roku przybywa kilka tysięcy pacjentów. Jak szacują epidemiolodzy, z tym problemem może zmagać się nawet co 10. Polak. Najczęściej chorują ludzie pomiędzy 45. a 75. rokiem życia. Ciekawe, ilu z nas wie, czy ich nerki pracują prawidłowo? Choroby nerek często rozwijają się długo, nie dając żadnych objawów, choćby bólu. Dopiero analiza krwi i moczu może pomóc wychwycić zmiany wskazujące, że w organizmie dzieje się coś niedobrego. Jeśli zauważamy któreś z wcześniej wymienionych symptomów, to już może być znak, że praca nerek zaczyna szwankować. Co ważne, niewydolności nerek sprzyjają: cukrzyca, nadciśnienie, miażdżyca, palenie papierosów i wiek, z czasem bowiem nasze ciało zaczyna gorzej funkcjonować. Dlatego przynajmniej raz do roku róbmy badanie krwi oraz badanie moczu. W ten sposób możemy zapobiec skutkom choroby. W każdej minucie przez nerki przepływa około litra krwi. Działają równocześnie jak filtr i oczyszczalnia, pozwalając organizmowi na wchłonięcie wody i substancji, których potrzebuje: białek, aminokwasów, sodu, potasu, wapnia, fosforu, a usuwają szkodliwe produkty przemiany materii. Ale to nie wszystko. Zapewniają równowagę zasadowo-kwasową organizmu, regulują ciśnienie krwi, wytwarzają erytropoetynę – hormon niezbędny do tego, by szpik kostny produkował czerwone krwinki oraz witaminę D, odpowiedzialną za stan kości. Od nich zależy działanie praktycznie wszystkich narządów.
Chore nerki długo nie powodują żadnych dolegliwości, a gdy już dadzą o sobie znać, np. w sytuacji stresowej, wtedy zaczyna chorować cały organizm. Chorują na nerki, ale nie mają tej świadomości. I to jest dla nas potężny problem, ponieważ na choroby nerek cierpi co najmniej 14-15 proc. dorosłych. To więcej niż w innych krajach, gdzie choruje 11-12 proc. Wynika to przede wszystkim ze stylu życia. Jemy niezdrowo, jemy dużo soli – więcej niż w innych krajach. Nie leczymy nadciśnienia tętniczego albo leczymy je źle. Co drugi pacjent, który trafia do leczenia nerkozastępczego (czyli taki, który już stracił czynność swoich nerek), nigdy nie miał rozpoznanej niewydolności nerek. Choroby nerek są po prostu nierozpoznawane. Można by pomyśleć, że żaden pacjent w Polsce nie umarł na nerki. Wszyscy umierają na serce, na udar, na raka. A podstawą zwiększającą częstość tych schorzeń jest właśnie choroba nerek. Ale nikt sobie z tego nie zdaje sprawy. Choroba nerek kilkakrotnie zwiększa ryzyko powikłań każdej innej choroby. Ktoś, kto ma chore nerki, ma ogromny problem z całym organizmem. Przykład: kobieta w ciąży z chorymi nerkami ma siedmiokrotnie większe ryzyko powikłań. Co gorsza, ona teoretycznie może mieć te nerki w pełni wydolne, z dobrymi parametrami; może trochę białka jest w moczu, trochę krwinek czerwonych, niby nic wielkiego. Ale faktycznie nerki mogą być już chore, co uwidoczni się w chwili stresu. Nerki są nieprawdopodobnie niedocenianym narządem, o czym się nie rozmawia. Choroba nerek często pozostaje niewykryta, gdyż nikt nie zadbał o to, żeby zrobić badania. Nie bada się w tym kierunku i stąd jest problem. A nie bada się, bo nie ma świadomości ani wśród lekarzy podstawowej opieki zdrowotnej, ani wśród społeczeństwa. Sama nerka nie daje żadnych objawów, powiedzmy sobie to jasno. Nawet jeżeli tworzą się kamienie nerkowe, to dają dolegliwości ze strony dróg moczowych, ze strony miedniczek, moczowodu – tam jest ból. Natomiast same nerki nie bolą, chyba że toczy się proces ropny, tak jak w odmiedniczkowym zapaleniu nerek lub przy ropniu nerki. Nawet rak nerki nie daje żadnych objawów, stwierdza się go najczęściej przypadkiem. Nie mamy wciąż, niestety, programu prewencji. Badanie moczu i kreatyniny to standardowe badanie przesiewowe wykonywane dla sprawdzenia, czy wszystko jest w porządku. Ludzie dbający o siebie powinni to robić – tak jak się bada piersi, robi cytologię czy kolonoskopię. Na te choroby są programy profilaktyczne, a na ten niezwykle ważny problem, jakim są chore nerki, nie ma. I to nie są wielkie pieniądze – badanie ogólne moczu i oznaczenie stężenia kreatyniny kosztuje mniej niż 10 zł. Rocznie wydalibyśmy na ten program może kilkanaście milionów. Natomiast oszczędności z tego tytułu byłyby ogromne. W tej chwili na leczenie chorób nerek, którym nie zapobiegliśmy, wydajemy 2 mld zł rocznie. Takie są koszty braku profilaktyki.
Troszkę może długie ale fajnie rozszerzony poruszony temat ! Najnowocześniejsze technologie wykorzystywane przez współczesną naukę pozwalają na poszukiwanie nowych, wczesnych, a przede wszystkim czułych markerów uszkodzenia nerek w moczu. Jest to materiał łatwy do uzyskania i niewymagający stosowania metod inwazyjnych. Ideałem byłoby zidentyfikowanie jednego czułego markera, którego oznaczenie dałoby wyniki łatwe do interpretacji i pozwoliłoby nie tylko na potwierdzenie uszkodzenia nerek, ale także na precyzyjne wskazanie miejsca uszkodzenia narządu w przypadku, kiedy w materiale biopsyjnym nie są jeszcze widoczne zmiany morfologiczne lub są one minimalne. Idealny marker powinien również umożliwić różnicowanie typów chorób nerek, ze wskazaniem na konkretny typ uszkodzenia, biorąc po uwagę dostępne dane kliniczne i ocenę stanu nerek po zastosowaniu konwencjonalnych parametrów klinicznych, z możliwością zastosowania w różnych populacjach, biorąc pod uwagę rasę, wiek i płeć. Prowadzone badania, związane z poszukiwaniem nowych markerów diagnostycznych, ukierunkowane są zarówno na poszukiwanie zmian w ekspresji genów (transkryptomika, genomika funkcjonalna), jak i na poszukiwanie nowych białek lub innych związków organicznych o niewielkiej masie cząsteczkowej (proteomika, metabolomika, metabonomika), pojawiających się w moczu w procesie chorobowym, bądź też w zaprojektowanym laboratoryjnie modelu danej choroby nerek. Problem braku odpowiednio czułego i wczesnego markera uszkodzenia nerek widoczny jest szczególnie w badaniach klinicznych, gdzie konieczna jest ocena efektu nefrotoksycznego badanych preparatów. Nowoczesne technologie, takie jak mikromacierze, pozwalają na analizę zmian w ekspresji wielu genów jednocześnie, co jest pomocne w wyłonieniu potencjalnych biomarkerów. Tym sposobem wytypowano kilka genów, których ekspresja zmienia się w przypadku ostrego uszkodzenia nerek Są to m.in. geny kodujące takie białka jak klusteryna, osteopontyna, S-transferaza glutationu α, lipokalina związana z żelatynazą neutrofilów (NGAL- 1 – neutrophil gelatinase-associated lipocalin), inhibitor metaloproteinaz typu 1 (TIMP-1), cząsteczka uszkodzenia nerek typu 1 (KIM-1 - kidney injury molecule), interleukina 18 (Il-18) oraz cystatyna C. Amerykańska Agencja ds. leków i Żywności (FDA) oraz Europejska Agencja ds. Leków (EMA) do oceny wczesnego uszkodzenia nerek przez preparaty testowane w badaniach klinicznych rekomendują stosowanie: KIM-1, klusteryny, cystatyny C, albumin i β2-mikroglobuliny oraz białka TFF3 (trefoil factor 3), a także stężenia białka w moczu. Badania ostatnich lat skupiają się na poszukiwaniu markerów wczesnej diagnostyki chorób nerek związanych z uszkodzeniem kłębuszków nerkowych. Wcześnie pojawiające się zmiany mogą być związane z uszkodzeniem podocytów lub zmianami w błonie podstawnej. Mogą być one wykrywalne jedynie przy zastosowaniu zaawansowanych technik laboratoryjnych, takich jak mikroskopia fluorescencyjna czy elektronowa, pozwalające na ocenę zmian w tkance na poziomie niedostępnym dla klasycznie stosowanej w ocenie bioptatów nerki mikroskopii świetlnej. Mianem podocyturii określa się obecność podocytów w moczu. Wskaźnik ten może być markerem uszkodzenia nerek. Wykazano, że podocyty są wydalane z moczem i można je hodować w warunkach in vitro. Badania związane z oceną liczby podocytów w moczu wskazują, że ocena podocyturii może być znacznie czulszym wskaźnikiem, aniżeli powszechnie stosowane oznaczenia stężenia białka w moczu. Co więcej, wykazano, że podocyturia występuje na długo przed pojawieniem się białkomoczu i wzrostem poziomu kreatyniny we krwi oraz innych objawów klinicznych, związanych z uszkodzeniem nerek. Określenie liczby podocytów wydalanych z moczem może być wskaźnikiem aktywności choroby nerek. Do identyfikacji podocytów w moczu stosuje się najczęściej metody mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystujące znakowane fluorochromami przeciwciała skierowane przeciwko białkom powierzchniowym charakterystycznym dla tych komórek. Najczęściej znakowane są: podokaliksyna (PDX), która jest zlokalizowana w części apikalnej komórki, nefryna i podocyna - białka błony szczelinowej oraz synaptopodyna, a także białko guza Willmsa 1 (WT1), pełniące funkcje czynnika transkrypcyjnego i ulegające ekspresji w jądrze komórkowym. Podejmuje się również próby analizy fenotypowej i ilościowej komórek kłębuszka nerkowego izolowanych z osadu moczu za pomocą cytometrii przepływowej. Do chwili obecnej nie zidentyfikowano jednak jednego markera charakterystycznego dla tych komórek, pozwalającego w łatwy sposób określić ich liczbę w próbce moczu. Co więcej, w moczu mogą znajdować się również komórki nabłonka ściennego torebki Bowmana (PEC - parietal epithelial cells), które również mogą wykazywać ekspresję białek charakterystycznych dla podocytów, np. podokaliksyny, dlatego też właściwa ocena uzyskanych preparatów komórkowych wymaga zastosowania określonego panelu przeciwciał, z jednej strony, oraz współpracy doświadczonego cytologa, z drugiej. Ponadto, metody oceny komórek w osadzie moczu są czasochłonne i niosą ze sobą ryzyko przeszacowania, ze względu na to, że poza podocytami, w osadzie moczu mogą znajdować się również fragmenty komórek, które uległy zniszczeniu w procesie patologicznego odklejania się od błony podstawnej, bądź też w trakcie przechodzenia przez drogi moczowe. Z tego też powodu należałoby udoskonalić metodykę pozyskiwania komórek z osadu moczu tak, aby była to metoda łatwa w wykonaniu oraz opracować metodykę identyfikacji izolowanych podocytów, charakteryzującą się dużą czułością i swoistością oraz wystandaryzować opracowane techniki tak, aby wyniki uzyskiwane przez poszczególne jednostki mogły być ze sobą porównywalne. Dotychczas brak jest również norm dotyczących liczby podocytów w moczu, zarówno wśród osób zdrowych, jak i w poszczególnych jednostkach chorobowych, do których można byłoby odnieść wyniki własnych oznaczeń. Wykazano, że podczas uszkodzenia nerek podocyty uwalniają do przestrzeni moczowej białka powierzchniowe. Za pomocą metod immunoenzymatycznych oraz techniką Western blot w moczu wykrywane są białka charakterystyczne dla podocytów, np. podokaliksyna, nefryna i podocyna (supernatant i osad moczu). Na podstawie tych obserwacji powstał termin nefrynurii, na określenie dużej zawartości nefryny w próbkach moczu. Nefrynurię opisano w wielu modelach eksperymentalnych oraz w chorobach przebiegających z białkomoczem. Co ciekawe, badania osób z cukrzycą typu 1 wskazują na znaczny poziom nefrynurii, nie związanej z mikroalbuminurią, który może sugerować wartość diagnostyczną tego wskaźnika w ocenie wczesnego uszkodzenia podocytów kłębuszka nerkowego, jeszcze przed wystąpieniem mikroalbuminurii . Podobnie, jak w przypadku nefryny, wykazano związek pomiędzy poziomem podokaliksyny w moczu (wyrażonym w stosunku do poziomu kreatyniny) a stopniem uszkodzenia nerek i nasileniem choroby w przypadku nefropatii IgA, toczniowego zapalenia nerek oraz popaciorkowcowego kłębuszkowego zapalenia nerek. Alternatywą dla wykrywania komórek nabłonka trzewnego kanalików nerkowych, czy też ich białek w osadzie moczu, jest ocena poziomu mRNA dla tych białek, z wykorzystaniem ilościowej metody łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR – quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction). Wykazano, że poziom mRNA dla nefryny i podocyny, w osadzie moczu, koreluje ze stopniem uszkodzenia nerek. Wielkość współczynnika opisującego stosunek ilości mRNA podocyny do mRNA nefryny (PNR) może stanowić użyteczny wskaźnik progresji choroby nerek. Co więcej, jak pokazały badania, poziom mRNA dla tych białek lepiej odzwierciedla stopień aktywności glomerulopatii aniżeli białkomocz. Ponadto, na podstawie tych parametrów można wykazać różnicę pomiędzy świeżo zaistniałym uszkodzeniem nerek a zmianami już istniejącymi . Podwyższony wskaźnik, opisujący stosunek pomiędzy ilością mRNA glikoproteiny B7.1 a mRNA nefryny w osadzie moczu, może być z kolei markerem różnicującym nefropatię zmian minimalnych (MCD - minimal-change disease) od ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych (FSGS, - focal segmental glomerulosclerosis) [20]. Użyteczność oznaczania profilu mRNA w moczu w różnicowaniu stopnia uszkodzenia nerek w nefropatii cukrzycowej wykazał zespół Zhenga. Na podstawie reakcji q-RTPCR wykazali oni związek pomiędzy poziomem mRNA dla białek podocytów tj. synaptopodyna, podocyna, podokaliksyna, białko CD2-AP i α-aktynina 4, a stężeniem kreatyniny w surowicy krwi, stężeniem białka w moczu oraz wielkością eGFR. Cytowani badacze wykazali również użyteczność metody wykorzystującej całe panele genów (mikromacierze mRNA) jako narzędzia charakteryzującego się wysoką wydajnością i czułością do oceny zmian w poziomie ekspresji mRNA w osadzie moczu, ze wskazaniem przyszłych kierunków poszukiwania nowych biomarkerów uszkodzenia nerek. Egzosomy to cząsteczki o średnicy 30 – 100nm, zbudowane z podwójnej błony białkowo–lipidowej, białek przezbłonowych oraz rdzenia hydrofilowego zawierającego białka, mRNA i microRNA. Różnią się one od innych tego typu cząstek wielkością oraz tym, że powstają w obrębie endosomów i uwalniane są na zewnątrz drogą egzocytozy. Egzosomy uważane są za nośniki horyzontalnego transferu informacji pomiędzy różnymi komórkami. W ten sposób mogą uczestniczyć w indukcji zmian epigenetycznych. Uwolnione z danego typu komórki, za pośrednictwem specyficznych ligandów, mogą wchodzić w interakcje z innymi komórkami, z biologicznie aktywnymi lipidami oraz specyficznymi białkami receptorowymi. Egzosomy obecne są we wszystkich płynach ustrojowych, w tym również w moczu. Jak wykazano, uwalniają je niemal wszystkie komórki nabłonkowe pozostające w kontakcie z przestrzenią moczową. Co więcej, wskazuje się na nie, jako na potencjalne markery diagnostyczne we wczesnym uszkodzeniu nerek. Egzosomy można w prosty sposób wyizolować z osadu moczu. W tym celu wykorzystuje się metody separacji z zastosowaniem kulek magnetycznych, sprzężonych ze specyficznymi przeciwciałami. Szeroko stosowane są również metody tj. ultrafiltracja moczu z zastosowaniem nanomembran, ultrawirowanie oraz ultrawirowanie w gradiencie gęstości, często połączone z chromatografią wykluczenia (SEC – size – exclusion chromatography), rozdzielającą cząsteczki w zależności od wielkości, a w niektórych przypadkach również masy. W dalszym etapie prowadzi się identyfikację wyizolowanych mikrocząstek za pomocą specyficznych przeciwciał znakujących białka powierzchniowe z zastosowaniem cytometrii przepływowej. W analizie morfologicznej i biochemicznej tych struktur wykorzystuje się mikroskopię elektronową i mikroskopie sił atomowych, immunoblotting, spektrometrię mas lub immunofluorescencję. Badania z zastosowaniem immunoblottingu mogą dostarczyć informacji na temat zawartości egzosomów i zmian tej zawartości, jakie zachodzą w różnych procesach patologicznych. Wykazano, że egzosomy mogą koncentrować czynniki transkrypcyjne. Z wykorzystaniem modelu ostrego uszkodzenia nerek (AKI) oraz modelu uszkodzenia podocytów kłębuszka nerkowego, wykazano podwyższony poziom aktywowanego czynnika transkrypcyjnego typu 3 (ATF3) w AKI oraz czynnika transkrypcyjnego guza Wilms`a (WT1) we wczesnym uszkodzeniu podocytów. Markerem wskazującym na wystąpienie AKI może być również obecność fetuiny-A w egzosomach izolowanych z moczu. Różnice w zawartości białek w egzosomach izolowanych z moczu, wykazano również u pacjentów z nefropatią IgA i nefropatią cienkich błon podstawnych. Wszystkie te obserwacje wskazują na potencjalną możliwość wykorzystania egzosomów w poszukiwaniu nowych biomarkerów. Ponadto egzosomy, będące nośnikami mRNA i microRNA, stanowią dodatkową pulę materiału genetycznego możliwego do oznaczenia. Jak wykazano, przeprowadzenie wydajnej izolacji egzosomów może w znacznym stopniu zwiększyć czułość i swoistość analiz mRNA z moczu. Jakkolwiek dotychczas brak jednoznacznych informacji na temat tego czy i w jakim stopniu uszkodzenie nerek, białkomocz czy też wystąpienie niedokrwienia wpływa na zmianę ilości egzosomów uwalnianych do przestrzeni moczowej. Mikrocząstki to struktury błonowe o średnicy 100 – 1000 nm, uwalniane z powierzchni komórek, złożone z fragmentu błony komórkowej zawierającej często białka powierzchniowe charakterystyczne dla tych komórek. Podobnie jak egzosomy, mikrocząstki stanowią integralny składnik mikrośrodowiska międzykomórkowego i można je odnaleźć we wszystkich płynach ustrojowych, w tym również w moczu. Ich ilość oraz skład może być wskaźnikiem zmian zachodzących w organizmie, dlatego też wiele badań koncentruje się na poszukiwaniu wśród nich potencjalnych biomarkerów. W badaniach podocytów i ich uszkodzenia w przebiegu kłębuszkowych zapaleń nerek wykazano, że poza komórkami nabłonkowymi i białkami powierzchniowymi, do przestrzeni moczowej uwalniane są także fragmenty błon podocytów, zawierające na swej powierzchni białka charakterystyczne dla tych komórek. Obecność struktur błonowych wykazujących ekspresje podokaliksyny wykazał zespół Hary. Cytowani autorzy analizowali osady moczu, pochodzące od dzieci z zespołem nerczycowym, metodą immunofluorescencji pośredniej. Wykazali oni obecność struktur niekomórkowych, wykazujących reakcję pozytywną z podokaliksyną. Szczegółowa analiza z zastosowaniem mikroskopii elektronowej pozwoliła na zidentyfikowanie tych struktur, nazwanych PPGS (podocyte positive granular structures), jako ziarnistości zbudowanych z błony komórkowej, niezawierających białek cytoszkieletu. Obecność na powierzchni podokaliksyny, może sugerować pochodzenie tych cząsteczek z części apikalnej komórki podocytów i odzwierciedlać dynamikę zmian w błonie komórkowej komórek kłębuszka nerkowego w odpowiedzi na uszkodzenie. Dalsza analiza wykazała brak markerów egzosomalnych na powierzchni tych struktur (CD24 i CD63), co sugeruje, że nie pochodzą one z egzosomów podocytów, a raczej z pęcherzyków mikrokosmków zlokalizowanych w części szczytowej podocytów kłębuszka nerkowego. Zmiany w ilości mikrocząstek wykazujących ekspresję podokaliksyny mogą świadczyć o zaistniałym uszkodzeniu w obrębie kłębuszka nerkowego. Jednakże, podobnie jak w przypadku oceny całkowitej liczby podocytów w osadzie moczu, brakuje jednego markera charakteryzującego mikrocząstki pochodzenia podocytarnego. MicroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki kwasu rybonukleotydowego, długości 20 – 22 nukleotydów, które uczestniczą w regulacji wielu procesów fizjologicznych. Te endogennie produkowane transkrypty stanowią element horyzontalnego transferu informacji. Wpływają na procesy ekspresji genów, poprzez blokowanie procesu translacji białek lub przez indukowanie degradacji powstałego RNA. Odkrycie tych cząsteczek na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia, zrewolucjonizowało dotychczasową wiedzę na temat mechanizmów regulacji ekspresji genów, mających wpływ na przebieg wielu procesów biologicznych, tj. proliferacja i różnicowanie komórek, apoptoza czy metabolizm, a także powstawania i rozwoju procesów patologicznych w komórkach i tkankach organizmu. Dzięki porównaniu profilu ekspresji miRNA w różnych narządach, wykazano istnienie grupy miRNA specyficznych dla nerki, składającej się z miR-192, miR-194, miR-204, miR-215 i miR-216. Dalsze badania wykazały zróżnicowanie ekspresji miRNA w obrębie kory i rdzenia nerki, co może wskazywać na istnienie różnic funkcjonalnych w obrębie tych cząstek. Specyficzność narządowa czyni miRNA doskonałymi kandydatami na nowe biomarkery powstawania i rozwoju zmian patologicznych w nerce. Dotychczas do oznaczania miRNA w materiale biologicznym wykorzystywano metody sekwencjonowania z puli całkowitego RNA. Dostępne dziś techniki typu blot RNA, pozwalają na jakościową i ilościową analizę wielu cząsteczek miRNA w próbkach całkowitego RNA. Rozwój technik z zastosowaniem mikromacierzy umożliwił oznaczenie jednorazowo do kilku tysięcy cząsteczek miRNA w jednej próbce. Do oznaczeń ilościowych i jakościowych miRNA w próbkach biologicznych zaadaptowano również technikę PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (real time reverse-transcription PCR). Związek pomiędzy regulacyjną funkcją miRNA a rozwojem zmian patologicznych w obrębie kłębuszków i kanalików nerkowych, wykazano po raz pierwszy u myszy z delecją genu kodującego Dicer w komórkach podocytów. Jest to enzym niezbędny do produkcji funkcjonalnych cząsteczek microRNA. U zmutowanych myszy zaobserwowano białkomocz, zmiany w błonie filtracyjnej kłębuszka, zmiany w morfologii podocytów (wakuolizacja i przerost komórek, odróżnicowanie, związane z zaburzoną strukturą białek cytoszkieletu oraz utratę ekspresji synaptopodyny), odklejanie się wyrostków stopowatych podocytów od błony podstawnej, zaburzenia w procesach apoptozy i proliferacji oraz wypadanie podocytów do przestrzeni moczowej i rozrost komórek mezangium. Obserwowano szybki postęp zmian prowadzących do albuminurii, szkliwienia kłębuszków oraz włóknienia cewkowo – śródmiąższowego, co prowadziło do schyłkowej niewydolności nerek i śmierci. Dzięki badaniom z zastosowaniem mutantów Dicer zidentyfikowano trio miRNA, charakterystyczne dla danego typu komórek w prawidłowym kłębuszku nerkowym: komórek endotelialnych (miR-126), komórek mezangialnych (miR-145) oraz podocytów (miR- 30a). Okazało się, że delecja Dicer wiązała się z całkowitą utratą zdolności do syntezy cząsteczek miRNA przez podocyty, co potwierdzał całkowity brak miR-30a, bez zmian w ekspresji miR-126 i miR-145. Badania wykazały istotną rolę miRNA w fizjologii i patologii nerki, w tym kłębuszków nerkowych i podocytów (szczególnie miR-30) i zapoczątkowały serię prac związanych z poszukiwaniem potencjalnych markerów uszkodzenia nerek. Zmiany w profilu miRNA wykazano m.in. w biopsjach nerki pacjentów z nefropatią cukrzycową, wielotorbielowatością nerek, nefropatią toczniową, nefropatią IgA, w guzach nerek, w procesie włóknienia oraz w odrzucaniu nerki przeszczepionej. Duże nadzieje na opisanie potencjalnych biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek, wiąże się z wykryciem miRNA we wszystkich płynach ustrojowych. Dotychczas opisano 22 różnych cząsteczek miRNA w moczu. Mimo że żadna z tych cząsteczek nie jest specyficzna dla nerki, badania wskazują na zmiany w profilu tych cząsteczek w moczu w różnych stanach chorobowych. Hanke i wsp. wykazali zmiany w ekspresji miRNA izolowanych z osadu moczu w raku pęcherza moczowego oraz w toczniu układowym. Na podstawie różnic w ekspresji miR-27b i miR-192, pochodzących z egzosomów izolowanych z moczu, dokonano różnicowania pacjentów z toczniem, któremu towarzyszy zapalenie nerek od tych, którzy takich komplikacji nie wykazują, oraz pomiędzy nefropatią kłębuszkową a cewkową, jak wykazano w modelu uszkodzenia nerek u szczura . Wśród pacjentów z nefropatią IgA wykazano obniżoną ekspresję miR-200a, miR-200b i miR-429, która korelowała z nasileniem choroby, ocenianym na podstawie standardowo oznaczanych parametrów funkcji nerek, w tym wielkości białkomoczu. Z kolei analiza poziomu miRNA, należących do grupy regulatorów odpowiedzi immunologicznej, w tej grupie pacjentów wskazała znacząco wyższy poziom ekspresji miR-146a i miR-155 zarówno w moczu, jak i w tkance, związany istotnie ze stopniem zaawansowania zarówno klinicznego, jak i histopatologicznego choroby. W badaniach miRNA izolowanych z moczu u dzieci z idiopatycznym zespołem nerczycowym wykazano znacząco wyższy poziom ekspresji miR-30a-5p, którego spadek korelował z poprawą kliniczną pacjentów uzyskiwaną w trakcie leczenia . Ponadto Wang i wsp. wykazali znacząco wyższy poziom miR-10a i miR-30d w moczu pacjentów z FSGS, w porównaniu z osobami zdrowymi, wskazując jednocześnie na potencjalną możliwość wykorzystania tych cząsteczek we wczesnej diagnostyce uszkodzenia nerek. Według autorów, ocena poziomu miR-10a i miR-30d charakteryzuje się wyższą czułością w porównaniu z klasycznie oznaczanym poziomem mocznika we krwi, w korelacji uzyskanych wyników z obrazem histopatologicznym. Za pomocą metody profilowania cząsteczek miRNA wykazano również 1,2-krotnie wyższy poziom miR-21 oraz 1,5-krotnie niższy poziom miR- 155 w moczu pacjentów z ostrą niewydolnością nerek, w porównaniu z grupą kontrolną. Badania z wykorzystaniem mRNA wykazały, że badane miRNA uczestniczą w regulacji ekspresji genów zaangażowanych w procesy apoptozy i proliferacji komórek. Autorzy wskazują na znaczenie tych dwóch typów miRNA w patogenezie ostrego uszkodzenia nerek oraz na możliwości diagnostyczne zarówno miR-21, jak i miR-155 we wczesnej diagnostyce tego typu uszkodzenia. Z kolei, Neil i wsp. porównywali poziom wybranych miRNA (miR-16, miR21, miR-155, miR-210 i miR-638) w moczu pacjentów w różnych stadiach przewlekłej choroby nerek (CKD – chronic kidney disease) oraz u pacjentów leczonych nerkozastępczo. Cytowani badacze nie wykazali istotnych różnic w poziomie ekspresji tych miRNA w różnych stadiach zaawansowania choroby nerek oraz w porównaniu z grupą osób zdrowych, za wyjątkiem miR-638, który wykazywał znaczący wzrost w moczu pacjentów znajdujących się w stadium 4 CKD, w porównaniu z grupą kontrolną i grupą w stadium 3 CKD. Uzyskane wyniki mogą sugerować, niewielki udział nerek w fizjologicznym usuwaniu krążących miRNA, a także na inny profil zmian w ekspresji tych cząsteczek w zależności od stopnia zaawansowania uszkodzenia nerek. Istnieje również możliwość, że miRNA w moczu ulegają degradacji w stopniu większym, aniżeli w osoczu krwi, ze względu na zwiększoną akumulację białek niskocząsteczkowych w moczu, tj. RNazy, które mogą mieć wpływ na poziom miRNA. Badania miRNA we krwi wskazują, że tylko niewielka część tych cząsteczek krąży swobodnie. Znaczna większość jest związana z nośnikiem, chroniącym je przed degradacja, którym mogą być mikrocząstki, kompleksy białkowe zawierające białka Argo-1 lub 2 lub też lipidy o wysokiej gęstości. Mimo wielu niewiadomych, badania nad miRNA trwają nadal, a wyniki wydają się być obiecujące zarówno w obszarze wczesnej diagnostyki chorób nerek, badań nad patogenezą, jak i w kontekście poszukiwania potencjalnych celów terapeutycznych. Dotychczas nie istnieje jeden czuły i swoisty marker diagnostyczny chorób nerek. Nadal istnieje konieczność wykonywania oznaczeń kilku parametrów oceniających funkcje nerek, zarówno w moczu, jaki i we krwi obwodowej. Ideałem byłoby skonstruowanie jednego konkretnego panelu markerów, którego oznaczenie w jednoznaczny sposób wskazałoby, nie tylko na zaistnienie uszkodzenia, ale również pozwoliłoby na sprecyzowanie miejsca w nefronie, gdzie takie uszkodzenie nastąpiło. Póki co, wykorzystując zdobycze współczesnej nauki w diagnostyce medycznej, poszukiwania takich markerów wciąż trwają. Biorąc pod uwagę coraz więcej doniesień na temat zaburzeń w ekspresji miRNA w chorobach nerek, jest nadzieja na zastosowanie tych cząsteczek nie tylko w badaniach nad patogenezą chorób nerek, w przewidywaniu wczesnych zmian i w diagnostyce klinicznej, a także jako cel terapeutyczny w przewlekłych chorobach nerek, osiągnięty dzięki możliwości takiego manipulowania poziomem miRNA, aby doprowadzić do przywrócenia właściwej ekspresji genów i usprawnienia funkcji nerek. ( autorzy publikacji: Agnieszka Czyżewska-Buczyńska, Andrzej Konieczny i wsp. )